Dans un château retiré, un éminent savant, le professeur Stangerson, poursuit ses recherches en compagnie de sa fille Mathilde et du fiancé de celle-ci, Robert Darzac.

 La chambre de Mathilde, qu'on appelle la chambre jaune, est toute proche du laboratoire; c'est de cette pièce qu'une nuit on entend un grand cri ponctué d'un coup de revolver. Stangerson se précipite, trouve sa fille inanimée, le revolver est par terre.

 Qui a pu pénétrer dans la chambre sans traverser le laboratoire et sans toucher au verrou ? L'énigme reste entière et l'enquête piétine.

 Rouletabille survient : c'est un journaliste tout jeune, vif, rieur et débrouillard. Il mène sa première grande affaire, délégué par son patron, Sainclair. Dans le château, il s'oppose très rapidement à un policier du nom de Larsan qui, lui aussi, essaie de percer le mystère de la chambre jaune.

 Curieux et perspicace à la fois, Rouletabille débrouille les fils de l'imbroglio, qui cache en réalité un drame de famille dont Mathilde est la triste héroïne. Longtemps auparavant, elle s'était éprise d'un individu et l'avait secrètement épousé. Ce n'était qu'un dévoyé, accusé de meurtre et qui avait pu échapper au châtiment. Les années ont passé, il connaît les expériences du professeur et aimerait s'intéresser à elles d'un peu plus près.

 Les coups de théâtre se succèdent : Larsan et l'homme qui a bouleversé la vie de Mathilde ne font qu'un. Démasqué, il disparaît. Et, si pourtant, il laissait une trace de son passage auprès de Stangerson ? Un enfant, un fils, qu'il a eu autrefois de Mathilde. Et si ce fils était Rouletabille ?

 Quant à l'énigme de la chambre, elle n'existait que dans l'imagination des enquêteurs. Mathilde, retirée chez elle, crut entendre quelque chose d'inquiétant. Elle s'affola, se heurta à un meuble, perdit connaissance et, en tombant, appuya sur la gâchette de son revolver. Elle n'avait troublé que des ombres et les fantômes de sa jeunesse.